Matériel disponible et protocole pour reproduire l'expérience historique de Hill :

Matériel :

Pour la préparation d'une suspension de chloroplastes :

- feuilles d'épinard

- balance

- ciseaux fins

- mortier et pilon +  sable

- éprouvette graduée

- pipette + propipette

- coton hydrophile

- entonnoir

- erlenmeyer entouré de papier aluminium

- solution de tampon phosphate saccharose

- solution de tampon tris-saccharose

Pour l'expérience de Hill :

- dispositif EXAO (bioréacteur, sonde O₂, lampe, seringue, agitateur)
- suspension de chloroplastes
- réactif de Hill (ferricyanure de potassium)

- seringue

- pipette 10mL + propipette

Protocole :

1. Extraction des chloroplastes des feuilles
- Peser 10 g de feuilles d’épinard , les découper en fines lamelles dans le mortier

ATTENTION : Ne pas confondre les 2 tampons à utiliser dans les deux prochaines étapes.
- Ajouter 3 ml de tampon tris saccharose et un peu de sable
- Commencer à broyer puis ajouter progressivement en cours de broyage 30 mL de solution tampon phosphate saccharose.
- Broyer fermement pendant au moins 2 minutes.
- Filtrer dans un entonnoir garni de coton hydrophile au dessus de l'erlenmeyer entouré de papier aluminium.
- Presser avec le pilon pour obtenir le maximum de filtrat.
- Conserver la suspension de chloroplastes à l’obscurité (erlenmeyer enveloppé de papier aluminium) jusqu’au moment de la mesure.

2. Expérience similaire à Hill  Utilisation du dispositif ExAO:

a) Montage (avant de réaliser la mesure) :

- Prélever 10mL de suspension de chloroplaste à l'aide de la pipette équipée d'une propipette

- Verser les 10 mL de suspension de chloroplastes dans le bioréacteur du dispositif EXAO

- Vérifier que l'agitateur est bien présent dans le réacteur.

- Fermer le bioréacteur

- Insérer délicatement la sonde oxymétrique dans le couvercle du bioréacteur

ATTENTION à ce que l'agitateur ne tape pas dans la tête de sonde

- Lancer l'agitation (agitation moyenne)

- Préparer la seringue contenant 0.3 mL de réactif de Hill sans l'introduire dans le bioréacteur

- Régler la position de la lampe

- Ajuster le volet du bioréacteur (ouvert ou fermé en fonction du moment de l'acquisition : voir ci-dessous)

b) Paramétrer le le logiciel ExAO :

- Démarrer le logiciel Atelier scientifique (icône AS sur le bureau)

- Choisir le module "Généraliste" = la grenouille

- Positionner l'oxymètre sur l'axe des ordonnées et choisir "liquide"

- Positionner le chronomètre sur l'axe des abscisses, paramétrer 12 min de durée d'acquisition

- Quand vous serez prêts cliquer sur le feu vert pour démarrer l'acquisition

Acquisition :

- 3 min à l'obscurité

- 3 min à la lumière

-  injection du réactif de Hill

-  3 min à la lumière

- 3 min à l'obscurité

Sécurité

Précautions de la manipulation