La mise en évidence du rôle des mitochondries

 

Différentes études et observations suggèrent que la respiration cellulaire se déroule dans les mitochondries, mais qu'une première étape est réalisée dans le cytosol, en dehors des mitochondries.

Lors de cette première étape, une scission et une déhydrogénation du glucose (C6H12O6) produirait 2 molécules d'acide pyruvique ( C3H4O3).

On cherche à identifier le substrat utilisé par les mitochondries glucose ou acide pyruvique. De plus on cherche à montrer l'importance de la chaîne d'oxydoréduction (chaîne respiratoire) dans la respiration cellulaire.

 

Pour étudier le rôle des mitochondries il est nécessaire de les isoler. Pour cela on utilise des cellules particulièrement riches en mitochondries comme par exemple les cellules de coeur. Les cellules subissent d'abord un broyage mécanique modéré afin de libérer les constituants sans les léser.

On suit l'efficacité de la respiration mitochondriale avec un système EXAO, en suivant la teneur en dioxygène dans le milieu.

 

Matériel

  • muscle de cœur  frais,

  • une balance électronique,

  • matériel de dissection (planche,  couteaux),

  • un hachoir électrique,

  • 1 coupelle,

  • 1 éprouvette,

  • un bécher, un erlenmeyer, une baguette de verre,

  • entonnoir, coton,

  • une pipette de 10ml + propipette,

  • 200ml de solution tampon pH7.2 ( milieu d'extraction),

  • une solution de glucose,

  • une solution de pyruvate (acide pyruvique),

  • une solution d'acide cyanhydrique (inhibiteur de la chaîne d'oxydoréduction mitochondriale),

  • système d'ExAO (Bioréacteur + sonde O2),

  • 3 petites seringues d'1 ml,

  • bassine + pissette eau distillée.

Mettre en œuvre le protocole.

 

Protocole :

  1. Peser environ 80 gr de cœur,  le découper en petits fragments puis  le déposer dans le hachoir électrique.

  2. Mesurer 130 ml de tampon avec l'éprouvette, les ajouter dans le hachoir électrique.

  3. Broyer le myocarde pendant  au moins 60 secondes.

  4. Verser le mélange dans un bécher de 250 ml.

  5. Homogénéiser à l'aide de la baguette de verre.

  6. Pour obtenir l'extrait contenant les mitochondries, poser l'entonnoir sur l'erlenmeyer, mettre le coton, puis filtrer.

  7. Déposer 10 ml  de filtrat dans la cuve du bioréacteur  puis oxygéner par brassage à l'aide de l'agitateur magnétique 10 minutes (sur le temps d'attente laver la verrerie).

  8. Arrêter l'agitateur, fermer le réacteur et mettre en place  la sonde à  O2  avec précaution .

  9. Remettre en route l’agitateur.

  10. Paramétrer l'expérience, suivre les instructions du logiciel, entrer la durée de l’expérience t = 12 minutes.

  11. A T0 lancer l'acquisition .

  12. Au bout d'1 minute injecter 1 ml de solution de glucose

  13. Au bout de 5 minutes injecter 1 ml de solution de pyruvate (acide pyruvique).

  14. Au bout de 9 minutes injecter 1 ml de solution  d'acide cyanhydrique.

  15. Imprimer le graphique

 

Graphique secours