Protocole

liste de matériel

  • navet,
  • boite de pétri,
  • balance,
  • mortier et pilon,
  • bécher 150 mL gradué,
  • éprouvette (au moins) 100 mL,
  • entonnoir,
  • papier filtre,
  • solution tampon  pH 7 
  • pipette de 10 mL + propipette.
  • Matériel ExAO, logiciel AS (atelier scientifique)
  • sonde  O2,
  • Solutions H2O2 : 0,25V,  0,5V, 1V, 4V, 10V, V20,

  • mini seringue,

  • eau distillée.

 

PRINCIPE  de l'expérimentation:
On réalise plusieurs expériences de 3 minutes en utilisant le substrat à H2O2 à différentes concentrations.
Chaque expérience s’effectue en 2 temps :

  1. Mesure de la concentration en O2 du milieu contenant l’enzyme sans substrat durant une minute.

  2. Au temps T = 1 minute faire l'injection de 0,15 mL de substrat à une certaine concentration et mesurer durant les 2 dernières minutes la concentration en O2 du milieu contenant l’enzyme et son substrat.

EXTRACTION DE LA CATALASE DU NAVET :
 

  • Peser 20g de navet émincer dans la boite de pétri,

  • Déposer le navet  pesé dans le mortier,

  • Broyer dans le mortier à l’aide du pilon en ajoutant progressivement 100 mL du tampon PH 7,

  • Filtrer le broyat dans un bécher de 150 mL,

  • Après avoir obtenu 50mL de filtrat, verser 25 mL dans l'éprouvette et compléter à 100mL avec le  tampon pH7,

  • Vider le filtrat restant dans la cuvette et rincer le bécher.

  • Verser le contenu de l'éprouvette dans le bécher puis coucher l'éprouvette dans la cuvette.


EXPERIMENTATION: détermination de l'évolution de la vitesse initiale

 

  • Introduire 6 mL de filtrat (extrait enzymatique) dans le réacteur et fermer celui-ci,

  • Préparer la mini seringue tubulée avec 0,15 mL de substrat (solution de H2O2) attention sans bulles d'air,

  • Mettre en place la sonde à O2,

  • Durée de l’expérience : 3 minutes,

  • Lancer l’agitation à vitesse moyenne,

  • Démarrer  la mesure (lancer l'acquisition),

  • Au bout d’1minute, introduire doucement les 0,15mL de substrat,

  • Laisser se poursuivre l’enregistrement jusqu’à 3 minutes,

  • Vider le bioréacteur,

  • Rincer le bioréacteur, la sonde et la mini seringue à l’eau distillée,

  • Réitérer l’expérience avec des concentrations en substrat croissantes (0,25V, 0,5V, 1V, 4V, 10V, 20V)
    en conservant toutes les courbes et en les superposant.