|
Préparation de la manipulation
- s’attacher les cheveux et se laver les mains au savon
- se désinfecter les mains au produit désinfectant à l'entrée de la
salle
- nettoyer la future zone stérile de la paillasse sous et autour du
bec électrique
- une zone non stérile comporte trois bains déjà préparés de
solution mouillante, d'éthanol et d'eau de Javel,
- les manipulations stériles se font sans parler et avec des gestes
lents
- allumer le bec électrique
Protocole :
à
lire en entier avant de commencer et vérifier que vous comprenez les
consignes
1.
préparation du milieu de culture
Vous disposez au bureau d'un milieu nutritif en poudre (minéraux,
oligoéléments, hormones etc.) additionné d'agar-agar, un gélifiant
qui permet une fois hydraté de donner un milieu de culture sous
forme de gel. Ce gel sert à la fois de support aux racines des
végétaux et de milieu nutritif. Cette première étape permet de
produire le milieu gélosé.
- sans les ouvrir, stériliser l'extérieur de vos deux tubes de
culture à l'aide d'un chiffon et de citrus, les poser à l'envers sur
le bouchon en zone stérile,
- avec le verre de montre aller peser au bureau
1,4 g de milieu de culture et les ramener à votre poste,
- avec la burette graduée mesurer 50 mL d'eau distillée stérile,
- verser ces 50 mL dans le bécher,
- ajouter le milieu de culture en poudre dans le bécher,
- suspendre le bécher dans la pince métallique au dessus du bec
électrique,
- agiter en permanence jusqu'à l’ébullition et continuer à
agiter durant environ 2min d’ébullition
- en tenant par la poignée la barre de la pince métallique,
desserrer la vis oblique qui la maintient et sortir le bécher du
feu, garder la pince en main et dans la
zone stérile
-
En zone stérile :
ouvrir le premier tube de culture, poser le bouchon à l'envers en
zone stérile, verser environ la moitié du contenu du bécher,
refermer le premier tube et le poser incliné dans son portoir,
-
En zone stérile :
ouvrir le second tube de culture, poser le bouchon à l'envers en
zone stérile, verser environ la seconde moitié du contenu du bécher,
refermer le second tube et le poser incliné dans son portoir
- si possible mettre les tubes au frais, inclinés.
2.
préparation de l'explant
La feuille va subir des bains de désinfection/rinçage successifs
dans la zone stérile avant que vous n'extrayez l'explant (le
fragment de végétal que vous allez mettre en culture). Organisez
votre plan de travail.
ATTENTION le
bain d’éthanol doit toujours rester en dehors de la zone stérile et
éloigné de la flamme : risque d’inflammation
- avec votre pince ( non stérile ) et les ciseaux ( non stériles) du
bureau prélever une feuille de Saint-Paulia et la rincer sous l'eau
du robinet,
- à votre paillasse, avec la pince non stérile, en zone non stérile,
immerger 5 minutes dans la solution mouillante,
- Avec la pince non stérile sortir la feuille de la solution
mouillante et l'immerger 5 minutes dans le bain d'éthanol en zone
non stérile,
- Avec la pince non stérile sortir la feuille du bain d'éthanol et
l'immerger 10 minutes dans le bain de Javel. Fermer la boite
contenant la Javel.
- transférer alors la boite de pétri de ce bain de Javel contenant
la feuille en zone stérile.
- En zone stérile : préparer 3
bains d'eau distillée dans les 3 dernières boites de Pétri,
- En zone stérile : avec la
pince stérile sortir la
feuille du bain de Javel et la rincer 5 minutes dans le 1er bain
d'eau distillée stérile, laisser la pince en zone stérile,
- En zone stérile : avec la
pince stérile refaire le rinçage une deuxième puis une troisième
fois dans les deux dernières boites.
- vous pouvez éliminer les bains de rinçage 1 et 2 après utilisation
- En zone stérile : dans le
dernier bain, avec le scalpel et la pince
stériles découper dans le limbe
(la partie plate) deux fragments carrés de 5 à 10 mm de côté sans
prendre le pétiole (la "nervure"), ce sont les explants.
3.
mise en culture des explants
Les explants ainsi que le milieu de culture sont prêts et sont
restés dans la zone stérile. Il ne reste qu'à mettre en culture.
- En zone stérile : vérifier que
votre gélose est bien prise en tournant le tube de culture incliné.
La gélose ne doit pas se désolidariser du tube !
- En zone stérile : ouvrir le
premier tube, encolure vers la chaleur et poser le bouchon en zone
stérile ouverture vers le haut, conservez le tube incliné
ouverture vers le bas
- En zone stérile : en faisant des
gestes lents avec la pince stérile prélever l'un des deux
explants dans le bain de rinçage et le déposer face inférieure
contre la gélose dans le tube que vous devez incliner, ouverture
vers la paillasse.
- En zone stérile : refaire la
même manipulation avec le second fragment dans le second tube.
- En zone stérile : fermer les
tubes avec les bouchons à vis et nommer chacun le votre en
ajoutant votre n° de spé.
4.
après la manipulation
Remettre la paillasse dans l'état dans lequel vous l'avez trouvée :
- éteindre le bec électrique,
- vider les liquides à l'évier,
- ramener les outils au bureau dans la 1ere cuvette
- ramener les boites au bureau dans la 2nde cuvette
|
